蛋白质组学时代的阿尔茨海默病药物治疗靶点研究

王闯，程玉芳，徐江平  编译

                               （药学院药理学系）

摘要：人类基因组计划的顺利实施使生命科学的研究逐渐由基因组学转移到蛋白质组学。利用蛋白质组学技术研究阿尔茨海默病成为热点。从蛋白质水平上研究其作用模式、功能机理、调节调控以及蛋白质组内的相互作用，从而为该病临床诊断、病理研究、药物治疗新靶点的发现等提供理论依据和基础。本文对以果蝇为研究模型进行的阿尔茨海默病研究，以及可能成为药物治疗新靶点的相关进展予以介绍。

关键词：蛋白质组学；阿尔茨海默病；靶点

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是现代医药工业的研究焦点。近期对人类的遗传学分析已经成功鉴定出部分AD遗传学相关基因，但是我们对该病的发生机制及其病因学的理解还十分有限。随着蛋白质组学时代的到来，分子生物学和分子遗传学的发展以及人类基因组计划的顺利实施，为人类疾病的认识提供了一条崭新的途径，这必将促进人们对疾病发病机制的认识及药物作用新靶点发现的进程。

1 AD及其研究模型

AD是一种以进行性、不可逆性的认知和记忆能力的衰退为主要表现的老年疾病。随着生活质量的提高，至少在工业化国家里，可以预见面临神经退行性变疾病的人群将会稳步增加。神经退行性疾病的大量出现也为治疗药物的研发提出了挑战，同时也为医药工业提供了巨大的市场。传统的研究神经退行性疾病的模型主要局限于啮齿类的小鼠和大鼠。如今，果蝇越来越多地被用于在体研究神经退行性变疾病的模型。由于该模型能够更精确地模拟疾病的表型、行为学及生理学特征，且相对于传统模型具有降低基因组复杂性的优点而受到越来越多的关注。用果蝇作为研究模型，通过遗传学分析已经阐明了多种疾病的信号通路，且这一模型对AD的研究潜力巨大。

2 β淀粉样蛋白（Aβ）和AD

AD是一种复杂的疾病，临床上主要通过行为学检测进行诊断。该病的病理学主要以Aβ聚集而成的脑源性淀粉样沉积的出现及大量产生为标志。Aβ主要分为两类，Aβ40和Aβ42，两者仅有两个氨基酸不同。尽管普遍认为是Aβ42水平的提高触发了疾病的发生，但是却发现两者在淀粉状沉积中共同存在，且与毒性相关。聚集态的Aβ被认为与疾病的病因联系紧密，但不是疾病发生的必要因素。最近的研究表明，寡聚体的可溶性Aβ42也对细胞存在毒性且能够引起疾病的相应表现。目前的研究方向聚焦于不同形式的Aβ的功能及在细胞内外的分布情况。

3 淀粉样前体蛋白（APP）:在细胞内的作用

Aβ40和Aβ42是通过内源性溶蛋白性裂解APP产生的，果蝇的APP样蛋白（APPl）是由果蝇的APP同系物产生的，已证实其具有严格的神经元定位，这一点与其在神经系统的作用是一致的。该蛋白的两种存在形式已经明确，一种是由N-末端区域组成的隐匿部分，一种是跨膜全蛋白。APP家族的蛋白都有一个可裂解的外功能区已经被认为是APP家族蛋白的成员，其中有12个种属中的17个成员已经被明确鉴定。APP家族包括哺乳动物的APP样蛋白1（APLP1）和APP样蛋白2(APLP2)。进化学研究表明APLP1，APLP2和果蝇的APLP 都是人类APP的同种异型基因,并且它们不包含Aβ区域。大量研究发现APLP在神经元功能中的作用，发现缺乏APLP的果蝇与APP裸小鼠相似，是形态学上的野生型，具有正常的生活力和生育力。然而，这些果蝇表现出的行为学上的缺陷可以通过转基因表达人类APP基因而得到部分缓解，这表明APP在两类生物中的保守性。深入研究果蝇幼虫神经肌肉接头处异位的APPl的表达证明其使突触形态学发生改变。APP诱导的突触生长表型在高兴奋性果蝇突变体中被改变，支持了此前关于神经活动影响APP代谢的结论。异位过度表达APPl已经被证明其可以诱导果蝇翅膀和肢体的缺陷，在这种果蝇中APP出现被轴突转运的现象。进一步深入研究高度表达或缺失APPl的实验表明，其最终可导致突触泡轴突转运的瓦解。为支持关于其转运作用的观点，通过APPl与编码顺行动力驱动蛋白-1组成部分的驱动蛋白重链之间的遗传相互作用的实验而证实。上述研究以及在体APP与驱动蛋白轻链通过蛋白质区域的直接粘合的研究说明APP/ APPl作为驱动蛋白-1受体的作用。在后来的研究中，Kamal等发现，APP包含突触泡也包括β位APP裂解酶（BACE）和早老素1（presenilin 1，PS1），这一发现就更加佐证了Aβ有轴突产生的可能性。尽管对APP/ APPl是否是驱动蛋白-1的唯一受体或者APLP1或APLP2也能调节这一功能还不清楚，但这一研究补充了APP可能沿轴突转运的模型，同时提供了可以解释APP的神经营养和/或神经保护作用的分子机制。然而必须指出的是，当前在AD方面的药物开发研究主要集中在疾病的发病过程，而忽视了其生理功能或APP的代谢过程。

4 γ-分泌酶：一个四聚体蛋白复合物

    两个独特的酶β和γ分泌酶调节着Aβ从APP前体的产生（如图1所示）。β-分泌酶包括一个单独的酶--BACE，这是一个具有跨膜区的特异性天冬氨酰蛋白酶。尽管果蝇基因编码天冬氨酰蛋白酶，但是生物信息学的分析目前还未鉴定出具有跨膜区的类BACE天冬氨酰蛋白酶。这一观察结果表明在果蝇中不存在APP的β-裂解酶，预示着BACE的活性可能在果蝇中缺失。相反的是，γ-分泌酶的裂解机制在果蝇上是十分固有的。γ-分泌酶包括一个高分子量的蛋白复合物，但是它的确切组成仍然不清楚。目前，研究表明这一蛋白产生四个组成基因：PS1，nicastrin,aph-1和pen-2，它们被认为是γ-分泌酶活性的组成部分。对果蝇和哺乳动物细胞的研究表明，其除了具有对APP的裂解作用外，早老素1也是Noth内膜裂解所必须的，这一过程最终导致Noth内膜区域（NICD）的释放，同时也改变与Noth信号转导相关的转录调节。与NICD的作用路径相似，APP的细胞内区域（AICD）已经被证明参与了Fe65的转录调节，Fe65是一种神经元反式转录作用因子和组蛋白乙酰基转移酶。Guo等人利用不同的研究方法，应用果蝇突变体，给予PS的过度表达，证实了PS影响Noth的亚细胞的分布。这些研究证明了早老素在APP和Noth这些跨膜转运蛋白中的运输作用。Noth信号通路在果蝇身上已经被很好地研究，并且证明该通路是众多发育路径中不可或缺的一个组成部分。然而，最近对APP和Noth相似性的发现却是喜忧参半的：在不影响Noth的前提下，给予Noth应用γ-分泌酶活性的多重作用，可以特异降低Aβ的产生，然而却可以带来有害的副作用。Nicastrin是γ－分泌酶复合物的第二个成员，其在与PS的物质相互作用的基础上孤立存在。应用果蝇胚胎，Chung和Struhl其后证实Nicastrin是APP跨膜裂解所必须的。γ－分泌酶的另两个活性成分aph-1和pen-2在C.elegans线虫上通过遗传筛选分离成功。这两个基因在随后的果蝇S₂的组织细胞培养中检测出来并发现其对APP和Noth的裂解作用。最近，Takasingi等人已经应用果蝇组织细胞培养阐明nicastrin,aph-1和pen-2在γ－分泌酶复合物中的作用。他们利用转染和RNA干扰技术设计出一个aph-1和PS相互作用的模型，证实二者的相互作用可使高分子量的PS和nicastrin的复合物更加稳定。在随后的研究中，Takasingi等人指出pen-2与该复合物的相互作用同时能调节PS的内源性蛋白水解作用并且能激活γ－分泌酶复合物的形成。

            图1  APP和Noth两跨膜区蛋白及β-分泌酶，γ-分泌酶对其的调节

5 Aβ转基因果蝇作为研究阿尔茨海默病毒性及清除机制的工具

最近应用果蝇作为模型系统去探讨关于大量神经退行性疾病中相关蛋白非正常表达的相关毒性问题被大量研究。在这一模型系统中，多聚谷氨酸的过度表达被认为是亨廷顿病和脊髓小脑共济失调的发病因素。该模型应用遗传筛选展示出其应用前景，其可以鉴别与疾病相关信号通路的相关细胞内组分。为了研究AD相关机制，我们已经应用果蝇设计出能说明Aβ42毒性和翻转作用的模型。通过在果蝇神经系统过度表达Aβ42，从而导致可见的疾病表型。（如图2所示）尽管果蝇具有很短暂的生命周期，但它却模拟了AD病理学的重要方面。因为Aβ的过度表达导致的效应具有年龄依赖性的特型，并且随后证明这些表型是由Aβ的不断聚集所导致的，疾病表型的严重性密切反映了果蝇蛋白提取物中Aβ42的聚集水平。不断聚集的肽的产生是Aβ的清除机制的衰减或仅仅由于肽的不断产生所引起的。在果蝇神经元组织的切片中观察到Aβ42的大量聚集，间接证明了Aβ参与了果蝇细胞分泌通路。在该模型上的遗传学相互作用的研究，将有助于阐明AD的相关信号通路，并对一种新型药物作用靶点的发现贡献巨大。

图2  Amyloid-β42 (Aβ42)过度表达导致的果蝇眼睛退变

6 Tau转基因果蝇和Wingless通路

高度磷酸化的Tau在 AD中的作用最近应用果蝇作为模型系统用来研究。Tau是一种微管相关蛋白，其在各种神经退行疾病中被异常磷酸化。家族型突变影响磷酸化位点，随后诱导神经纤维缠结（NFTs）的形成，这一现象在很多疾病中被发现，如额颞叶痴呆。最近在转基因小鼠中的研究证明Aβ与 Tau具有协同效应，实验发现协同表达APP和Tau转基因动物表现出更加强烈的缠结聚集，而仅仅表达Tau转基因小鼠则表现出更加局限的Tau相关病理学效应。与人类同系的Tau最近在果蝇上克隆成功，果蝇Tau编码的蛋白46％同源性,66％与人类的Tau蛋白的微管相关区域相似。Tau在发育的脑和腹神经索表达，并且持续表达贯穿于整个幼虫阶段和成虫期，其中主要表达在视觉系统。已经在神经细胞和非神经细胞，细胞质和轴突的突起和末端发现了该蛋白。尽管还没有分离出果蝇的Tau突变体，但是果蝇用于研究 Tau在正常神经元发育中的作用和它的微调效应具有发展潜力。为了设计出 Tau调节的神经退行性变疾病模型，在果蝇的神经系统过度表达人Tau的野生型和突变系被诱导成功。当Tau在眼睛过度表达时，导致了视网膜的破坏，而且当其在脑中表达时，引起脑中空泡的形成。为了证明 Tau过度表达的细胞特异性，应用合适的基因增强子在特异性神经元亚型上直接表达 Tau获得成功。这一实验证明了Tau可诱导胆碱能神经元而不是多巴胺能神经元Terminal的受损，模拟了AD中胆碱能神经元的高度易损性。Jackson等人证明在果蝇中表达人类Tau与Wingless通路组分具有相互作用，这是由正常走向疾病众多途径中较为复杂的部分。这一研究表明Shaggy—果蝇糖原合成酶激酶3β的同系物可能直接磷酸化Tau，而不依赖于通过β-连锁蛋白和T细胞因子/淋巴增强因子作用的Wnt通路。Jackson等人的研究还证明其表达Shaggy和Tau可导致更加严重的神经退行性变的表型，且高度磷酸化的Tau的原纤维的聚集与AD患者脑中发现的结构相似。尽管还不清楚它们是疾病的原因还是结果，但包含Tau的NFTs是严重神经退行性变疾病的特征，而果蝇模型的出现支持了果蝇作为Tau相关表型模型的观点。

7 果蝇中胆固醇和阿尔茨海默病的关系

   除了有APP和Presenilin基因突变引起的AD，人类载脂蛋白E4（apoE4）的出现，又成为AD的又一独立的危险因素。尽管对于apoE4携带者对于AD患者的危险性的分子机制仍然不清楚，但研究者已经发现，apoE4在AD患者胆固醇代谢中具有潜在的联系。许多研究都表明胆固醇的水平和病理性Aβ的产生存在联系。特别指出的是Aβ的加工过程出现在可能有胆固醇组成的膜室区—Lipid rafts.通过他汀类药物抑制胆固醇的合成降低了由β-分泌酶调节的Aβ的加工过程。临床研究支持这一观点，并且已经证明给予他汀类药物的患者降低了AD的发病率。最近在果蝇上通过在遗传学水平上对löchrig 突变体的神经退变表型进行了研究。Löchrig被鉴定认为是影响果蝇生命周期的突变体，且是神经退变相关的表型。克隆的Löchrig基因表现出在胆固醇合成中的作用，因为其编码AMPK的γ-亚单位。AMPK与脊椎动物的胆固醇合成有关，其用以负性调节羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）。生物化学分析表明，löchrig 突变体的提取物中胆固醇酯减少，而游离态的胆固醇水平没有变化。为支持在哺乳动物中的研究，Tschäpeet 等人突变体columbus，这是编码果蝇HMG-CoA还原酶同系物的基因，它可以抑制被löchrig导致的神经退行性变表型。遗传相互作用的深入研究，Tschäpe等人证明果蝇同系物APPL的缺失可促进löchrig诱导的脑退行性变，这一效应与降低löchrig突变体的Processed APPL的量相关。在同一研究中，一个Columbus突变体被证明APPL加工过程的降低，这就提供了löchrig突变体引起的神经退行性变的效应与Columbus和APPL加工过程的依据。尽管AMPK和HMG-CoA在昆虫中具有保守性，但其升华作用与人类不同，如昆虫不能直接生成胆固醇。然而，上述遗传学分析描述了胆固醇通路中APPL加工过程中的作用，并且指出这一通路可能参与了AD的发病。用果蝇作遗传学分析能够进一步阐明AD中这一代谢过程的问题。

结论：阿尔茨海默病的果蝇模型有何优点？

 无脊椎动物对AD的研究贡献巨大，这里我们已经概述了果蝇模型的产生及其用于提高我们对AD病因学知识的相关问题。大量的果蝇的突变体对于理解基因在疾病通路中的作用及其研究疾病表型与基因的减少或缺失之间的相关性提供了一个具有价值的工具。再者，还可以用于研究通过组织特异性诱导表达系统诱导的过度表达所带来的效应，因此，就可以创造出“功能获得”突变体。RNAi技术的应用也相应扩大了基因功能的分子交换组分。培养的果蝇细胞可以应用长双链RNA片段转染导致目标RNA效力的减弱。应用生物化学和荧光测定的基因组范围的RNAi 筛选最近被报道。最近应用双杂交方法绘制的“相互作用图谱”被出版。该图谱描述了20405种蛋白相互作用，其中包括7048种果蝇蛋白。这一研究强调了果蝇用于提高技术进步和基因组范围研究的应用性。这一研究也能在AD研究领域作出贡献。尽管APP和PS的基因在果蝇中具有保守性，并且无明确证明Aβ由果蝇内源性产生，但是它的产生可能是一种进化性适应，而只出现于哺乳动物这种生命周期较长的生物。虽然APP，PS和γ－分泌酶的复合物的其它组分的正常功能在果蝇中是保守的，但对这种生物的分析可以让我们全面理解它所调节的通路。在者，在果蝇中过度表达对人类有毒性的蛋白质可以模拟神经退行性变疾病的行为学和组织病理学特点。这一过度表达Aβ果蝇株 对分析AD病理学因素导致的通路破坏是一种有价值的工具。（表1）它们同时也对调节毒性反应的基因和参与整个毒性剂代谢的基因的鉴别，最终为发现未来疾病治疗的新靶点具有十分重要的帮助和意义。

表1  果蝇中AD相关基因分析